Как провести окрашивание по граму. Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты Окрашивание по граму микробиология

1. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, окрашенной карболовым генцианвиолетом, и смачивают несколькими каплями воды.

2. Через полторы-две минуты бумажную полоску снимают и на препарат наносят раствор Люголя на 1 минуту.

3. Сливают раствор Люголя и, не промывая водой, действуют спиртом несколько секунд, до прекращения отхождения красителя от мазка.

4. Тщательно промывают препарат водой.

5. Докрашивают разведенным фуксином 1-2 минуты.

6. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают препарат с иммерсионной системой.

Грамположительные микробы - фиолетового цвета, грамотрицательные - красного.

2. В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий иногда используют неокрашенные препараты (нативные), приготовленные из естественный образцов либо из колоний выросших микроорганизмов. Нативные препараты чаще всего готовят для исследования живых неокрашенных бактерий в целях установления их подвижности. Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя светлопольный микроскоп с приспущенным конденсором, но лучше всего его исследовать в темном поле или с помощью фазово-контрастного микроскопа. Для прижизненного изучения бактерий часто используют методы «висячей капли», «раздавленной капли», микрокамеры с плотными средами.

Препарат «раздавленная капля» готовят на предметном стекле, на которое наносят каплю воды. В нее стерильной бактериологической петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры, эмульгируют и накрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если исследуют бульонные культуры, то на предметное стекло наносят непосредственно ее каплю. Препарат микроскопируют с использованием объективов х40 или х90.

Препарат «висячая капля» используют при продолжительном наблюдении за ростом и развитием микроорганизмов. Небольшая капля бульонной культуры микроорганизмов помещается с помощью бактериологической петли на стерильное покровное стекло. Стекло переворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло с лункой. Капля должна свободно свисать в лунку, не затрагивая ее краев и дна. Для создания влажной камеры и предохранения от высыхания края лунки смазывают вазелином. Микроскопируют также, как и препарат «раздавленная капля».

Микрокамеры с плотными средами готовят на стерильных предметных стеклах с тонким слоем питательного агара. С помощью пастеровской пипетки наносят бактерии. Обрезают агар вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло. Для предотвращения высыхания такие препараты либо инкубируют в закрытой камере, либо герметизируют щели между стеклами путем заливки парафином или воском.

Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитри-хиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания. Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, КА1(SO4)2, НgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности.

Подвижность бактерий может быть выявлена путем использования техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 - 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды.

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Методика окраски по Граму

2. Приготовление препарата «висячая капля» из живых подвижных бактерий (вибрион), микроскопирование в фазово-контрастном микроскопе.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Приготовить препараты из грамположительных и грамотрицательных культур (стафилококка, антракоида, кишечной палочки, вибриона), окрасить по Грамму, микроскопировать, зарисовать.

2. Приготовить препарат «раздавленная капля» из зубного налета и чистой культуры водного вибриона, микроскопировать в темном поле, зарисовать результат.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. В чем заключаются различия в анатомии эукариот и прокариот?

2. Какие свойства бактерий можно изучить в результате окраски простыми и сложными методами?

3. Какие методы окраски называют дифференциальными? Назовите их.

4. Какие свойства бактерий влияют на их способность воспринимать

разные красители?

5.Какой метод окраски позволяет разделить все бактерии на две альтернативные группы?

6.Каково строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий?

7. Объясните последовательность и механизм окраски по Граму. В какой цвет при этом могут окрашиваться бактерии и почему?

8. Назовите морфологические разновидности грамположительных и грамотрицательных бактерий.

9. Какое значение имеют жгутики в биологии бактерий?

10. Как определяют подвижность бактерий микроскопическим методом?

11. Как определяют подвижность бактерий методом посевов?

12. Какое практическое значение имеет изучение подвижности бактерий?

13. Как готовятся «висячая» и «раздавленная» капли и каковы особенности их микроскопии?

14. Какие существуют варианты расположения жгутиков у бактерий?

15. Как обнаружить жгутики у бактерий?

ЗАНЯТИЕ №3

Тема:

Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски (продолжение).

План занятия:

1. Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля - Нильсена.

2. Выявление спор у бактерий. Окраска по Ожешко.

3. Выявление капсул у бактерий. Окраска по Бурри-Гинсу.

4. Выявление включений по методу Нейссера.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

1. Кислотоустойчивые бактерии обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, щелочам и спиртам, что связано с наличием в теле микроба нейтральных жиров, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведенными растворами красителей. Для выявления кислотоустойчивых бактерий применяют концентрированные красители, приготовленные в растворе карболовой кислоты, и подогревание. Карболовая кислота при подогревании разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства. При последующем воздействии серной или азотной кислотой тело микробной клетки не обесцвечивается, что дает возможность отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от бактерий, не обладающих этим свойством. К патогенным кислотоустойчивым бактериям относятся палочки туберкулеза и проказы. К непатогенным - палочка смегмы, нередко находящаяся в моче человека, а также микробы, встречающиеся в организме холоднокровных, на различных злаках, в почве, навозе, молоке, масле. В отличие от туберкулезных бактерий они обесцвечиваются спиртом. Окраска кислотоустойчивых микробов производится по методу Циля - Нильсена.

2. Споры у бактерий образуются при неблагоприятных условиях существования микроба. По расположению споры могут находиться в центре микробной клетки, например у сибиреязвенной палочки, ближе к концу; субтерминально - у Cl.perfringens; и на конце (терминально) - у палочки столбняка. Спорообразование наблюдается среди некоторых палочковидных бактерий и актиномицет. Образование спор происходит в присутствии кислорода и при температуре не ниже 15° и не выше 43°. Споры очень устойчивы к температуре, погибают при кипячении в течение 2-6 часов, при стерилизации в автоклаве (при температуре 120°) погибают в течение 16-30 минут. Споры у бактерий служат для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды.

Бактериальные споры могут быть выявлены с использованиемкак простых, так и сложных методов окраски. Простой метод: микроорганизм, например, с использованием 7 % водного раствора нигрозина, окрашивается в зеленый цвет, споры при этом бесцветные, а фон - черный. Наиболее часто применяют сложные методы окрашивания эндоспор по Ожешко и по Шефферу - Фултону.

3. Капсула располагается поверх клеточной стенки и представляет ослизненную клеточную оболочку. Патогенные бактерии образуют капсулу только находясь в организме животных или человека, а при культивировании может появляться при добавлении к питательной среде нативного белка. Капсула защищает их от действия фагоцитов и антител. "Капсульные" бактерии образуют капсулу и в организме, и на питательных средах, где они дают характерный слизистый рост. Для обнаружения капсул у бактерий применяют специальные методы окраски. Чаще всего используется метод Гинса.

4. В цитоплазме бактерий могут находиться различные по своей природе включения, такие как липопротеидные тельца, гликоген, гранулеза, пигментные скопления, сера, кальций. У некоторых бактерий в цитоплазме встречаются зерна волютина. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans , по наименованию которых волютин получил название, у Bacillus subtilis , а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило названиеметхромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами - запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп. Наличие гранул волютина учитывают при лабораторной диагностике дифтерии, так как для этого возбудителя характерно биполярное расположение зерен. Метод Нейссера основан на избирательной фиксации зернами волютина уксусно-метиленовой синьки Нейссера. При последующем окрашивании везувином краска Нейссера вытесняется из бактериальной цитоплазмы, которая принимает теперь желтую окраску. Зерна волютина, прочно фиксировавшие метиленовую синьку, остаются темно-синего (почти черного) цвета, а палочки - желтого.

Цель занятия

1. Освоить методы микроскопического выявления структурных элементов клетки (споры, капсулы, включения, оболочка кислотоустойчивых бактерий).

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Структурные элементы бактериальной клетки, их назначение и роль в распознавании микробов.

2. Методы микроскопического изученияструктурных элементов бактериальной клетки:

Оболочка кислотоустойчивых бактерий (окраска по Цилю - Нильсену)

Споры (окраска по Ожешко);

Зерна волютина (окраска по Нейссеру);

Капсулы (окраска по Бурри и по Бури - Гинсу).

Уметь:

1. Окрашивать препараты сложными методами в целях выявления кислотоустойчивых бактерий, спор, зерен волютина у дифтерийной палочки, капсул у бактерий.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Для выявления туберкулезных бактерий обычно исследуют мокроту. Пинцетом или препаровальными иглами наносят комочек мокроты на середину предметного стекла, затем его покрывают вторым пролетным стеклом, так чтобы одна треть нижнего и одна треть верхнего стекла были свободными. Затем берут за свободные концы стекла и растирают комочек между ними, после чего раздвигают оба стекла. Таким образом, получаются два мазка, которые затем высушивают на воздухе и фиксируют на пламени.

На фиксированный мазок мокроты, для окраски туберкулезных бактерий по Цилю - Нильсену, кладут листок фильтровальной бумаги размером меньше предметного стекла и наливают на него карболовый фуксин Циля. Окрашиваемый мазок подогревают на пламени до появления пара, который хорошо заметен, если смотреть на препарат сбоку, так его подогревают 2-3 раза.

Препарату дают остыть, сбрасывают бумажку с краской и наносят 5% серную или 25% азотную кислоту до появления желтого окрашивания, после чего быстро и тщательно промывают водой.

Докрашивают препарат метиленовой синькой в течение 4 -6 мин, после чего промывают водой, высушивают и рассматривают под иммерсионной системой.

Туберкулезные палочки окрашиваются в рубиново - красный цвет, а форменные элементы, некислотоустойчивые бактерии в синий цвет.

Для окрашивания спор по методу Ожешко готовят густой мазок на одном конце предметного стекла и высушивают на воздухе, после чего на него наносят 1% раствор соляной кислоты и нагревают на пламени до появления паров в течение 1-2 минут. Препарат промывают водой, высушивают, фиксируют на пламени и окрашивают по методу Циля - Нильсена. При иммерсионной микроскопии обнаруживают красного цвета споры и синего цвета вегетативные тела.

Метод Шеффера - Фултона : фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который наносят 0,5 % водный раствор малахитового зеленого и 2 - 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления паров. Сняв фильтровальную бумагу, препарат промывают водой и в течение 30 сек. докрашивают 0,5 % раствором сафранина и вновь промывают водой. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетка - в красный.

Для выявления капсул по методу Гинса на предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий. Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок, как мазок крови: ребром одного стекла проводят по поверхности другого. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой. На темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой.

Для выявления зерен волютина на фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 мин. Сняв бумагу, промывают мазок водой. Наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания. Промывают водой, докрашивают мазок водным раствором этиленового синего в течение 3-5 мин., вновь промыв водой, высушивают и микроскопируют

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Приготовление препаратов из нативной мокроты иих окраска по Цилю-Нильсену.

2. Окрашенные препараты, приготовленные из мокроты туберкулезных больных и из чистой культуры дифтерийной палочки.

3. Споры антракоида, окрашенные по методу Шефера-Фултона.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1. Приготовить препарат из культуры Corynebacterium, окрасить по Цилю-Нильсену, микроскопировать и зарисовывать.

2. Приготовить препарат из Кl.pneumoniae или К1.ozaenae методом Бурри-Гинса, микроскопировать и зарисовать их.

3. Микроскопировать окрашенные по Ожешко препараты спор антракоида и зарисовать их.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие палочковидные формы принято называть бациллами?

2. В каких условиях образуется капсула у бактерий?

3. В каких условиях образуется спора у бактерий?

4. Каково назначение капсулы у бактерий?

5. Каково назначение споры у бактерий?

6. Какие химические вещества входят в состав капсулы?

7. Как обнаружить капсулу у бактерий?

8. Каким преимущественно формам бактерий присуще спорообразование?

9. Как можно убить спору?

10. Чем обусловлена кислотоустойчивость спор?

11. В какой цвет окрашиваются кислотоустойчивые бактерии по методу Циля-Нильсена?

12. Чем обусловлена кислотоустойчивость бактерий?

13. Каково назначение зерен волютина?

14. Как можно выявить зерна волютина?

15. Что такое метахромазия?

16. Какое значение имеетобнаружение зерен волютина у бактерий?

ЗАНЯТИЕ №4

Тема:

Морфология спирохет, грибов, риккетсий, хламидий, простейших, вирусов (бактериофагов).

План занятия:

1. Особенности морфологии спирохет.

2. Изучение морфологии нитчатых и дрожжеподобных грибов.

3. Морфология облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий и хламидий).

4. Изучение морфологии простейших.

5. Морфология вирусов. Бактериофаги: строение бактериофагов, получение бактериофагов, титрование. Применение в медицине.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Спирохеты (трепонемы, боррелии, лептоспиры). Бледная трепонема вызывает сифилис, боррелии - возвратный тиф и клещевой боррелиоз (болезнь Лайма), лептоспиры - желтушный лептоспироз.

Оболочка спирохет тонкая, эластичная, содержит большое количество липопротеидов и тонкий не сплошной слой пептидогликана. Обычными методами трепонемы не окрашиваются, так как при фиксации спиртом оболочка легко разрушается и клетка не в состоянии удерживать красители. Спирохеты также, как и простейшие, плохо окрашиваются анилиновыми красителями. Для их дифференцирования применяют краску Романовского-Гимзы или микроскопируют нативные препараты в темном поле или в фазово - контрастном микроскопе (при сифилисе, лептоспирозе).

Грибы представляют собой растительные организмы, лишенные хлорофилла. В отличие от бактерий, клетки грибов имеют дифференцированное ядро и размножаются бесполым и половым способом. По особенности строения мицелия и образования половых спор грибы делят на несколько классов.

Представители класса фикомицетов имеют несептированный мицелий и относятся к низшим грибам (мукоровая плесень). Мукоровые грибы представляют собой сильно разветвленную клетку, от которой отходят плодоносящие гифы - спорангеносцы с шароподобными образованиями наверху - спорангиями, наполненными эндоспорами. К классу аскомицет относятся аспергиллус и пенициллиум. Аспергилус имеет расчлененный мицелий, одноклеточный конидиеносец, на головке которого веерообразно расположены короткие стеригмы, от которых отшнуровываются экзоспоры (при микроскопии напоминают струйки вытекающей из лейки воды). У пенициллиума и конидиеносцев многоклеточных, плодоносящее тело имеет вид кисточки. Представители этих двух классов грибов широко распространены в природе и, как правило, ведут сапрофитический образ жизни. В отдельных случаях могут вызывать поражение дыхательных путей, среднего уха, глаз.

Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Диаметр клеток варьирует в пределах 2-15 микронов. Клетки дрожжеподобных грибов одеты отчетливо заметной оболочкой, имеют цитоплазму, компактное ядро, вакуоли и разнообразные включения. Почкование является единственной формой размножения этих грибов. Форма почек округлая или слегка грушевидная. Наружных спор (типа конидий), и внутренних (типа аскоспор), дрожжеподобные грибы не образуют, чем и отличаются от истинных дрожжей, аскомицетов и конидиальных организмов. Некоторые виды Candida образуют хламидоспоры, диаметр их достигает 10 -20 микронов, форма округлая, оболочка толстая, двухконтурная. Хламидоспоры возникают на концах псевдомицелия из укрупненных клеток, называемых протохламидоспорами.

Настоящего мицелия дрожжеподобные грибы также не имеют. Образование нитей (филаментация) происходит за счет удлинения клеток и расположения их в длинные цепочки. Такие нити называют псевдомицелием и отличаются они от истинного мицелия тем, что не имеют общей оболочки и перегородок, а состоят из длинных клеток, образующихся путем последовательного бокового или концевого почкования. В патологии человека определенную роль играют дрожжеподобные грибы из рода Candida, поражающие чаще всего слизистую желудочно-кишечного тракта.

Лучистые грибки - актиномицеты - по строению совмещают свойства бактерий и грибов. В патологии человека встречаются актиномицеты, вызывающие актиномикоз - заболевание, характеризующееся образованием лучистых друз в гнойно-воспалительных инфильтратах различных тканей. Представители семейства Streptomycetaceae служат источником для получения антибиотиков.

По П. Ф. Здродовскому, наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы развития риккетсий): 1) кокковидные (0,5мкм), 2) палочковидные (короткие -1-1,5мкм), 3) бациллярные (длинные, изогнутые - 3 – 4 мкм), 4) нитевидные (20 -40мкм). Все формы полиморфны.

Риккетсии окрашивают по Граму (грамотрицательны), по Романовскому - Гимзы и по Здродовскому.

Хламидии - грамотрицательные, мелкие кокковидные бактерии, размножаются только в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, т.е., как и риккетсии, они относятся к числу облигатных внутриклеточных бактерий. Попавшие в чувствительную клетку элементарные тельца хламидий превращаются в ретикулярные тельца, которые делятся пополам. После нескольких делений образуются промежуточные формы, превращающиеся затем в элементарные тела. У человека хламидии вызывают трахому, орнитоз и венерическую болезнь.

Хламидии обычно выявляются в клетках плоского, а не цилиндрического эпителия. Клетки с хламидиями располагаются группами по 4 - 6 штук; хроматин в них распределен причудливо, грубые его нагромождения чередуются с просветлениями, цитоплазма клетки слегка вакуолизирована. В части случаев хламидии располагаются в виде внутриклеточных элементарных телец. Позднее они становятся крупнее, делаются менее плотными и располагаются внутри крупной вакуоли вблизи ядра. Хламидии чувствительны к тетрациклинам, макролидам и рифампицину, а L-формы бактерий чувствительны к эритромицину и рондомицину.

Хламидии окрашивают по Романовскому - Гимзе, они хорошо видны в нативных препаратах при фазово-контрастной микроскопии. Чаще всего для их выявления в соскобах клеток применяют метод иммунной люминесцентной микроскопии.

Простейшие имеют более сложную функциональную организацию по сравнению с бактериями и грибами. Снаружи тело простейших покрывает эластичная и ригидная мембрана - пелликула, образованная внешним слоем цитоплазмы. У некоторых видов клеточная мембрана может включать опорные фибриллы и даже минеральный скелет. Клеточная структура и набор органоидов идентичен клеткам многоклеточных животных организмов. Многие простейшие активно двигаются за счет псевдоподий, жгутиков или ресничек.

Выявление патогенных простейших основано на идентификации морфологических особенностей возбудителя и значительно зависит от правильного взятия клинического материала и адекватной фиксации.

Морфология простейших изучается как в живом их состоянии, так и в окрашенном виде. Простая окраска (фуксином или метиленовой синей) непригодна, так как она не позволяет выявить сложную структуру этих микроорганизмов. Наиболее простым способом, дифференцирующим отдельные элементы клетки, является метод окраски по Романовскому - Гимзе. При этом фиксация мазков должна производиться не на пламени, а в каком-либо фиксаторе (например, смесью спирта с эфиром по Никифорову). При выявлении подвижности лучшие результаты достигаются, при применении подогрева предметного столика и исследовании в первые 30 минут после взятия материала.

Вирусы - автономные, проходящие через бактериальные фильтры генетические структуры, способные функционировать и репродуцироваться в восприимчивых клетках животных, растений, бактерий, простейших, грибов.

Вирусная частица - вирион состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной белковой оболочкой - капсидом. У некоторых вирусов капсид покрыт дополнительной оболочкой. Капсид состоит из субъединиц - капсомеров, имеющих чаще всего симметричное строение. Особенностями вирусов являются: фильтруемость, неспособность размножаться на искусственных питательных средах, отсутствие собственных белоксинтезирующих систем, наличие только одной какой-либо нуклеиновой кислоты, дисъюнктивный (разобщенный) способ размножения.

Вирусы, поражающие бактерии (бактериофаги), имеют сперма-тозоидную форму. Они состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту, и отростка. Некоторые фаги не имеют отростка, или он очень короткий. Проникновение фага в бактериальную клетку может закончиться гибелью клетки и выходом фага (продуктивная инфекция-вирулентный фаг). В других случаях геном фага интегрирует с геномом клетки. Клетка не погибает, а геном фага репродуцируется с геномом клетки. Такая культура бактерий называется лизогенной. Лишь в отдельных клетках лизогенных бактерий фаг размножается и вызывает гибель клеток (умеренный фаг). Бактериофаги получают путем фильтрации материала через бактериальные фильтры. Количество бактериофагов можно определить путем серийных разведений с последующим добавлением их к индикаторным бактериям, выращиваемым на жидкой питательной среде (метод Аппельмана) или выращиваемым на плотной среде в чашках (метод Грациа).

Цели занятия:

1. Изучить особенности строения спирохет, хламидий, риккетсий, нитчатых и дрожжеподобных грибов, простейших, вирусов, в том числе бактериофагов.

2. Познакомиться с лечебно-профилактическими и диагностическими препаратами из бактериофагов.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Морфологию спирохет (трепонем, боррелий, лептоспир).

2. Морфологию нитчатых и дрожжеподобных грибов.

3. Морфологию простейших (лямблий, трихомонад, токсоплазм, дизентерийной амебы, малярийного плазмодия).

4. Морфологию хламидий, риккетсий и вирусов, в том числе бактериофагов.

5. Получение бактериофагов, титрование, применение в медицине.

Уметь:

1. Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов в готовых препаратах.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Методика окраски спирохет по методу Романовского-Гимзы.

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет.

Для изучения морфологии грибов необходимо на предметное стекло нанести каплю воды, в которую препаровальными иглами вносится и расправляется мицелий грибов; препарат прикрывается покровным стеклом и рассматривается под сухой системой микроскопа. Мицелий у мукора одноклеточный, несептированный, а у аспергилла и пеницилла-многоклеточный. У мукора органы плодоношения представлены в виде большого спорангиеносца с эндоспорами, у аспергилла конидиеносцы несептированные в виде лейки, у пеницилла - сортированные в виде кисти рук.

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить.

2. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцвечивание - удаление комплекса генцианового фиолетового с

Йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс ген-цианового фиолетового с йодом.

Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спиртом. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грам-отрицательным - гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимости от возраста культуры, особенностей культивирования и других факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Грама, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена

1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть 3-5 мин до появления паров.

2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

3. Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1 -2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить и микроскопировать.

В основе метода лежат протравливание (разрыхление) клеточной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: раз-

ветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они плохо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окрашенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Препарат промывают водой.

5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Этапы окраски по Граму представлены на стенде.

Конец работы -

Эта тема принадлежит разделу:

Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки

Студент должен иметь представление.. о механизмах окраски структурных компонентов бактерий клеточной стенки.. работа изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ:

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Морфология прокариот. Методы выявления: окраска, микроскопия
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучить морфологию прокариот; особенности ультраструктуры бактерий, функции отдельных структур; ознакомиться с методами приготовления и окрас

Морфология прокариот
Цель:сравнить формы и размеры микроорганизмов на примере кишечной палочки, стафилококка и гриба кандиды (см. теоретическую справку). Самостоятельна

Морфология прокариот
Бактерии - это одноклеточные прокариоты растительного происхождения, но лишенные хлорофилла. Видны в световой микроскоп, размеры их измеряются в микрометрах. Размножение происходит

Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска
Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить. 1 этап. О

Методы окраски
Простые методы (ориентировочные) Сложные методы (дифференцирующие) 1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов. 2. Окрашивают одним кр

Окраска по Цилю-Нильсену
Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов,

Окраска по Ожешко
Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым

Окраска по Романовского-Гимза
Методика окраски по Романовскому-Гимзе: Краска Романовского-Гимза состоит из метиленового синего, эозина и азура. 1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 ка

Самостоятельная работа во внеурочное время
1. Дайте определение: а) морфологические свойства - __________________________________________________ ____________________________________________________________________________

При обработке мазков (срезов) из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни из содержащихся в мазке бактерий также обесцвечиваются, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, фуксином Пфейффера) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом (нагреванием). Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов.

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1-2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30-60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2-3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).

Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: возможен механический перенос микробов с одного мазка на другой, что может отразиться на результатах микроскопии. Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя (протравой) и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы (в том числе и rpaмположительные) обесцветятся. На густой, толстый мазок (например, из агаровой культуры) время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. При воздействии спиртом на неравномерно приготовленный мазок в толстых его частях микробы остался необесцвеченными, а в тонких обесцветятся; получится «пестрая» картина окраски, что может привести к неправильным выводам.

Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах (несколько часов роста) из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2-3 раза крупнее взрослых особей (18-часовых), очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек.

Для начинающих, а также в сомнительных случаях, рекомендуется на том же стекле, где находится исследуемый мазок, приготовить по сторонам контрольные препараты - один из культуры микробов, заведомо грамположительных, а другой - из грамотрицательных.

При обесцвечивании препарата в окраске по Граму спирт можно наливать непосредственно на мазок, постоянно покачивая стекло. Лучше же обесцвечивание проводить в кюветках, куда наливают спирт и, захватив пинцетом Корнэ препарат, поднимают и опускают его, следя за цветом стекающего со стекла спирта. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10-30 секунд, в зависимости от толщины мазка.

Спирт 96° в кюветках следует чаще сменять (80° спирт уже неправильно дифференцирует мазок). Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки.

Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. По данным Саватеева, достаточно добавить 2-4 мл 10% йодной настойки на 100 мл 95° спирта; раствор может сохраняться долгое время. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием.

Для обесцвечивания мазков йодированным спиртом достаточно двух минут, после чего следует промывка водой и дополнительная окраска фуксином Пфейффера.

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1-2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30-60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2-3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

studfiles.net

Мир науки

Окраска по Граму – основной метод окраски в бактериологии. С окраски по Граму начинается описание морфологических свойств. Такое значение этого метода обуславливается тем, что окраска бактериальной клетки по Граму зависит от типа строения её клеточной стенки и, соответственно, принадлежности к отделу Firmicutes или Gracilicutes – первого этапа идентификации любого вида в бактериологии. Окраска по Граму осуществляется в четыре этапа.А. На первом этапе фиксированный мазок окрашивается генциановым фиолетовым.

1. Окрашивание продолжается 1 – 2 минуты.2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии окрашиваются этой краской в синий цвет.Б. На втором этапе мазок обрабатывается раствором Люголя, который формирует с генцианвиолетом красящий комплекс, локализующийся на цитоплазматической мембране.1. Обработка раствором Люголя продолжается 1 – 2 минуты.2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии на этом этапе остаются синими.В. На третьем этапе мазок обесцвечивается спиртом.1. Обесцвечивание спиртом продолжается примерно 20 секунд с последующим обильным промыванием водой.2. Грамположительные бактерии за это время не успевают обесцветиться и остаются синими, а грамотрицательные, вследствие более тонкого слоя пептидогликана, препятствующего вымыванию спиртом красящего комплекса, обесцветиться успеют и, следовательно, станут бесцветными.Г. На четвертом этапе мазок окрашивается водным фуксином или другой красной краской – сафранином.1. Докраска красной краской продолжается 1 – 2 минуты. Причем, этот этап лучше продлить подоль-ше, так как после обесцвечивания бактериальная клеточная стенка воспринимает краску хуже, чем обычно.2. Грамположительные бактерии остаются синими, так как они уже окрашены более темной краской а грамотрицательные, которые на предыдущем этапе обесцветились, на этом этапе окрашиваются в красный цвет. Д. Грамположительные бактерии составляют меньшую часть тех бактерий, которые изучает меди-цинская микробиология. Ниже приводятся основные (этот перечень будет позже добавлен неспорооб-разующими анаэробами).1. Грамположительными являются большинство кокков (кроме нейссерий): стафилококки, стрепто-кокки и пневмококки, энтерококки.2. Среди палочек грамположительными являются листерии, бактерии актиномицетного ряда (актино-мицеты, микобактерии, коринебактерии), спорообразующие палочки (бациллы и клостридии).Е. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение, грамотрицательные. Лишь по отношению к микоплазмам не корректно говорить об их грамотрицательности (хотя по Граму они окрашивались бы в розовый цвет – если бы их так окрашивали, так как на практике этот метод в изучении микоплазм не применяется). Дело в том, что грамоложительные и грамотрицательные бактерии отлича-ются друг от друга типом клеточной стенки (прежде всего – количеством содержащегося в ней пепти-догликана), а у микоплазм клеточной стенки с содержанием пептидогликана нет.1. Из кокков грамотрицательные – нейссерии.2. Грамотрицательными являются большинство палочек (собственно все, за исключением перечисленных выше грамположительных).

3. Клеточную стенку грамотрицательного типа имеют также спирохеты.

Page 2

Основной функцией белков главного комплекса гистосовместимости является представление антигенных пептидов в такой форме, в которой их могут распознать рецепторы Т-клеток. Как именно антигенный пептиды попадают в

Подробнее: Процессинг и презентация антигена

Содержимое клеток можно извлечь, растирая ткань между вращающимися стеклянными поверхностями (гомогенизация) или при помощи различных химических методов, разрывая плазматическую мембрану.

Подробнее: Органеллы клеток - биология

Плазмалемма не только образует барьер между вне- и внутриклеточном жидкостями, но и участвует в межклеточных взаимодействиях, формирующих ткани организма. Некоторые клетки, например в крови, не связаны друге другом, а плавают в жидкости (плазме и г. и).

Подробнее: Межклеточные контакты - биология

worldofscience.ru

Исследование морфологических свойств микробов

Приготовление фиксированного препарата и окраска его по Граму

А. Приготовление фиксированного препарата.

Препараты бактерий готовят на предметных стеклах, которые должны иметь толщину, не превышающую 1,2-1,4 мм. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена. В повседневной работе достаточно натереть сухое чистое стекло сухим хозяйственным мылом, после чего тщательно протереть сухой хлопчатобумажной салфеткой; на хорошо обезжиренном стекле капля воды равномерно расплывется (не сохраняет каплевидную форму).

На обезжиренное предметное стекло наносят небольшую каплю водопроводной воды и переносят в неё профламбированной (стерильной) биологической петлей незначительное количество исследуемого материала. Биомассу бактерий вращательным движением петли растирают в капле воды на площади примерно 4 см 2. Слой должен быть настолько тонким, что мазок высыхает почти сразу после приготовления.

Высушивание мазка следует проводить при комнатной температуре на воздухе. Если оно замедлено, то препарат можно слегка нагреть в токе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить крайне осторожно, не перегревая препарат, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация мазка преследует несколько целей: убить микроорганизмы, приклеить их к стеклу, обеспечить лучшее окрашивание. Для того, чтобы зафиксировать мазок, нужно три раза провести предметное стекло через самую горячую часть пламени горелки, держа его мазком вверх.

Б. Окраска препарата по Граму.

На зафиксированный мазок помещают фильтровальную бумажку и наносят краситель генцианвиолет на 1,5-2 мин. (на этой стадии операции необходимо следить, чтобы краситель проходил на мазок через фильтр). Далее фильтровальную бумагу убирают и наносят на мазок раствор Люголя также на 1,5-2 мин. Раствор Люголя сливают и обрабатывают мазок 96%-м этиловым спиртом в течение 30 сек. Затем мазок промывают водой, докрашивают фуксином Циля (1,5-2 мин.) и промывают водой до «светлой капли». Далее мазок высушивают, наносят на него иммерсионное масло и изучают в микроскопе при увеличении объектива 90х.

Методы исследования живых клеток

А. Препарат «раздавленная капля»

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в неё небольшое количество культуры изучаемых микроорганизмов. Взвесь бактерий размешивают и прикрывают покровным стеклом. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания её покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жидкости необходимо удалить фильтровальной бумагой, которую затем следует сразу опустить в дезинфицирующий раствор.

Б. Препарат «висячая капля».

Каплю суспензии микроорганизмов биологической петлей наносят на покровное стекло, которое затем переворачивают каплей вниз и помещают над лункой специального предметного стекла (стекло с лункой). Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином для герметизации камеры.

В. Препарат «отпечаток»

Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло таким образом, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат (покровное стекло) помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии предметным стеклом.

Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа. После микроскопирования такие препараты перед мытьем должны быть выдержаны в дезрастворе.

Цитохимические методы исследования строения микробов

А. Окраска капсул и приготовление красителей

а) Окраска капсул

Для окраски капсул применяют методы Михина, Ольта, Ребигера, Романовского-Гимза, Гинса, негативный метод Бурри.

Метод Михина. Фиксированный мазок окрашивают синькой Леффлёра в течение 2-3 мин. при подогревании (до появления паров), после чего краску быстро смывают водой и мазок высушивают между листами фильтровальной бумаги. Клетка окрашивается в темно-синий цвет, капсула - в светло-розовый.

Метод Ольта. Фиксированный препарат окрашивают 2-3%-м водным раствором сафраина в течение 1-3 минут (лучше при подогревании) и быстро промывают водой. Раствор сафраина готовят перед употреблением, растворяя краску в воде, доведенной до кипения, затем фильтруют через бумажный фильтр. Клетки окрашиваются в красно-коричневый цвет, капсулы - в бледно-желтый.

Метод Ребигера. Окрашивают и фиксируют препарат одновременно формалиновым раствором генцианвиолета. Нефиксированные мазки окрашивают 15-20 сек., быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Клетки окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, капсулы - в красновато-фиолетовый.

Метод Романовского-Гимза. Краску фабричного приготовления перед окрашиванием мазков растворяют из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Разведенную краску наливают на дно чашки Петри, в которую кладут две тонкие стеклянные палочки или спички. Мазок, зафиксированный метиленовым спиртом, помещают в чашку до соприкосновения с краской (бактерии находятся на нижней плоскости мазка). Окрашивание проводят 30-40 минут. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Клетки окрашиваются в сине-фиолетовый, а капсулы - в красно-фиолетовый цвета.

Негативный метод Бурри. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю туши, разведенную в 10 раз дистиллированной водой. В тушь вносят каплю исследуемой культуры и хорошо смешивают. Полученную взвесь другим стеклом равномерно распределяют по поверхности предметного стекла, высушивают на воздухе. Препарат рассматривают с иммерсией. На темно-дымчатом фоне хорошо видны неокрашенные капсулы и клетки бактерии.

Метод Гинса. На край предметного стекла наносят каплю туши, вносят в неё клетки, хорошо перемешивают и ребром другого стекла делают мазок по всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5-10 минут жидкостью Никифорова или 3 минуты абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивается фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:3. Время окрашивания 2-3 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией. На темно-сером фоне выделяются розово-малиновые клетки, окруженные бесцветными капсулами.

Окраска капсул бактерий по Муромцеву. На фиксированный мазок наносят краситель Муромцева на 30-40 сек., мазок промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. Микроскопическая картина - капсулы розовые, бактерии - темно-синие.

б) Приготовление красителей для окраски капсул.

Синька Леффлера. Насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини: 1,6 г метиленового синего растворяют в 100 мл 95%-го этилового спирта.

30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают со 100 мл 0,01%-го раствора КОН.

Раствор КОН: 0,01 г КОН развести в 99,99 мл дист. воды.

Раствор сафраина. 3 г сафраина смешать с 97 мл дистиллированной воды, довести до кипения, профильтровать. Краска готовится перед употреблением.

Формалиновый раствор генцианвиолета. 15-20 г генцианвиолета растворить в 100 мл 40%-го формалина, оставить на 6-8 часов при комнатной температуре, профильтровать, после чего он готов к употреблению.

Краситель Романовского-Гимза. Готовый реактив разводят перед употреблением: 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.

Смесь Никифорова. Этиловый спирт и серный эфир в равных объемах.

Комбинированная краска по Муромцеву. Первый раствор - фуксин основной - 0,15 г, спирт этиловый 96%-й - 20 мл, карболовая кислота кристаллическая (фенол) - 10 г. Второй раствор - метиленовый голубой - 2,5 г, вода дистиллированная - 200 мл. Оба раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Б. Определение кислотоустойчивости бактерий.

Кислотоустойчивость - свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость связана с особенностью химического состава клеточной стенки этих бактерий: в ней содержится много сложных липидов и миколовых кислот.

На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки. На препарат помещают фильтровальную бумагу и заливают карболовым фуксином Циля и затем 2-3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку; при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ой серной кислотой. Для этого предметное стекло 2-3 раза погружают в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3-5 минут синькой Леффлера. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсией. Кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые - синий. Кислотоустойчивость можно определять у клеток любого возраста.

Реактивы для определения кислотоустойчивости.

Фуксин Циля. 5 %-й раствор свежеперегнанного фенола 100%, насыщенный спиртовой раствор фуксина основного - 10 мл. Приготовленную смесь отфильтровывают через 48 часов. Краситель устойчив при хранении.

Другой способ получения фуксина Циля: фуксин основной - 1 г, фенол кристаллический - 5 г, спирт 96 %-й - 10 мл, глицерин - несколько капель, вода дистиллированная - 100 мл. Основной фуксин растворяют в этаноле, затем добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют.

В. Окраска спор и приготовление реактивов.

а) Окраска спор

Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид светлых включений на фоне почти черных клеток.

Эндоспоры обладают многослойными труднопроницаемыми оболочками, поэтому при простой обработке препарата спорообразующих бактерий фуксином или генцианвиолетом споры не окрашиваются. При микроскопировании они обнаруживаются в клетке в виде бесцветных включений. Свободные споры имеют вид колец.

Метод Пешкова. Мазок готовят на обезжиренном предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленовой сини по Леффлёру. Краситель доводят до кипения, держа стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания, - 10-20 сек. Затем предметное стекло охлаждают, тщательно промывают водой и докрашивают в течение 30 сек. 0,5%-м водным раствором нейтрального красного или сафраина. Краситель сливают, мазок промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры - синий цвет. Вместо метиленового синего можно использовать другой краситель - малахитовый зеленый. В этом случае фиксированный препарат заливают на 7-10 минут 7,5%-м раствором малахитового зеленого. Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают и докрашивают 0,25%-м водным раствором сафраина в течение 1-2 минут. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки - в розовый.

Метод Циля - Нильсена в модификации Мюллера. На фиксированный над пламенем мазок наливают 5%-й водный раствор хромовой кислоты, которую через 5-10 минут смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров, но не до кипения, потом отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя (так в течение 7 минут). При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения мазка её снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются. Поэтому для обесцвечивания цитоплазмы препарат затем обрабатывают 1%-м раствором соляной или серной кислоты в течение 15-30 секунд. При превышении этого времени может обесцветиться и спора. Затем препарат промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2 мин. Если все операции проделаны правильно, окраска получиться контрастной и споры ярко-красного цвета будут четко выделяться на голубом фоне цитоплазмы.

б) Реактивы для окрашивания спор бактерий

1. Карболовый фуксин Циля (см. выше).

2. Метиленовый синий Леффлёра (см. выше).

3. Насыщенный водный раствор метиленового синего: 2 г красителя растворить в 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5%-й раствор.

5. Кислота соляная или серная, 1%-й раствор.

6. Сафраин, водный раствор: 2,5%-й раствор сафраина в 96%-м этаноле - 10 мл, вода дистиллированная - 100 мл.

7. Малахитовый зеленый: малахитгрюн - 7,5 г, вода дистиллированная - 92,5 мл.

8. Метиленовый синий насыщенный спиртовой раствор: метиленовый синий - 3 г, 96%-й спирт - 100 мл. Раствор оставляют на 2-3 дня, несколько раз перемешивают, потом фильтруют. Раствор устойчив.

9. Метиленовый синий по Леффлёру (другой рецепт): 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего растворить в 100 мл дистиллированной воды, добавить 1 мл 1%-го водного раствора КОН.

Г. Окраска жгутиков

а) Приготовление препарата

Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если он не окрашен особым способом, который увеличивает толщину жгутиков. Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они основаны на использовании различных протрав, осаждающихся на поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увеличивается в диаметре и они становятся видимыми в световом микроскопе. Окраска жгутиков требует тщательной подготовки культуры и аккуратности в работе, так как жгутики легко обламываются даже при легком взбалтывании культуры.

Для подготовки культуры рекомендуется ежедневно несколько дней подряд делать пересевы культуры на свежую питательную среду в жидкую среду или в конденсационную воду свежей скошенной агаризованной среды. Кроме того, в день просмотра можно брать петлей материал и переносить в пробирку с 5-6 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 37°С. Не рекомендуется болтать петлей в воде, бактериальная масса сама должна в течение 30-60 мин разойтись в ней.

Прежде чем приступить к работе, необходимо проверить подвижность клеток в висячей капле. В случае отсутствия подвижности пробирку оставляют в термостате на 1,5-2 суток.

Для приготовления препаратов необходимы совершенно чистые предметные стекла. Их кипятят в растворе бихромата калия в крепкой серной кислоте, затем дважды промывают в растворе едкого натра. После этого стекла промывают водой и хранят в банке с 96%-м спиртом. Пред приготовлением мазка следует сильно нагреть ту сторону стекла, на которую будет нанесен мазок, но наносить его надо на охлажденное стекло.

б) Методы окрашивания.

Метод Леффлёра. Суспензию бактерий наносят на стекло пастеровской пипеткой или петлей (3-4 маленьких капли) и сушат при комнатной температуре. Допускается фиксация мазка быстрым одноразовым проведением через пламя. Далее препарат заливают протравой на 3-5 минут при нагревании до появления паров или 15-20 минут при комнатной температуре, потом промывают сильной струей дистиллированной воды 30 сек. и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат карболовым фуксином Циля 3-4 минуты при легком нагревании до появления пара (фуксин содержит 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей воды, или в соотношении 1:1). Затем препарат промывают водой и исследуют с иммерсией. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в розовый цвет.

Метод Фонтана. В пробирку с 0,5 мл стерильной водопроводной воды вносят клетки, взятые на границе с конденсационной водой. Материал берут осторожно, слегка касаясь культуры, а не вести биологической петлей по поверхности агара. Петлю с бактериальной массой оставляют в воде на 1 час. За это время подвижные бактерии окажутся свободно взвешенными в воде. Затем петлю вынимают, прокаливают, охлаждают и только после этого ею берут капли взвеси бактерий и осторожно наносят на обезжиренное предметное стекло. Нанесенные капли не размазывают, они должны быстро высохнуть, лучше в термостате. Мазки фиксируют 5 минут жидкостью Руге. Препарат промывают водой, заливают протравой (см. ниже) и подогревают стекло до появления паров в течение 2 минут. Протраву сливают, препарат тщательно промывают водой. Далее обработку препарата проводят серебрением: разбавленный аммиачный раствор серебра наливают на мазок и стекло несколько раз осторожно подогревают в течение 2-х минут до появления паров. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Бактерии в препарате окрашены в черный или темно-коричневый цвет, а жгутики (часто спутанные) - в светло-коричневый или желтый.

Метод серебрения жгутиков по Морозову. Препарат готовится, как описано выше. На препарат наливают на 1 минуту реактив №1. Затем его сливают, промывают водой и наливают реактив №2. Подогревают на слабом пламени до появления паров, тщательно промывают водой и 1-2 минуты (при подогревании) обрабатывают препарат реактивом №3 до появления темно-коричневой окраски мазка. Мазок тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

в) Реактивы для окраски жгутиков.

Приготовление протравы: 12 г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды, добавляют 30 мл насыщенного раствора железного купороса FeSO4 и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 96%-м спирте. Смесь готовят за несколько дней до употребления, хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте. Перед употреблением фильтруют.

Краситель: карболовый фуксин Циля и дистиллированная вода в соотношении 1:1. Готовят перед употреблением и фильтруют.

Реактив №1: 1 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл формалина 40%-го, 100 мл дистиллированной воды. Это жидкость Руге.

Реактив №2: протрава - танин (5 г), фенол кристаллический (1 г) и дистиллированная вода (100 мл).

Реактив №3 (реактив для серебрения): азотнокислое серебро - 5 г, раствор аммиака, вода дистиллированная - 100 мл. К 3-4 мл 5%-го раствора азотнокислого серебра по каплям прибавляют раствор аммиака до помутнения и образования осадка, а затем осторожно до растворения осадка. После этого вновь прибавляют раствор серебра до появления легкой опалесценции. Полученный раствор аммиачного серебра разводят дистиллированной водой в 10 раз.

Д. Окраска включений клеток микроорганизмов

Окраска гликогена. Гликоген - животный крахмал часто накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для выявления гликогена к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют гранулы гликогеноподобных веществ, окрашенные в красновато-коричневый цвет.

Окраска гранулёзы. Гранулеза - крахмалоподобное вещество. Гранулеза в больших количествах накапливается в клетках маслянокислых бактерий. Анализ проводят аналогично выявлению гликогена. Гранулеза окрашивается в синий цвет.

Окраска жира. Жир содержится в клетках почти всех микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры.

На предметное стекло наносят небольшую каплю 40%-го раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру микроба. Формалин убивает клетку и разрыхляет оболочку. Через 5 минут добавляют каплю метиленового синего и спустя 10 минут каплю судана III - индикатора жироподобных веществ. Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Цитоплазма клеток окрашиваются в синий цвет, включения жира - в розово-оранжевый.

Бактерии в качестве резервных липидов образуют гранулы поли-бета-оксимасляной кислоты. Для их выявления готовят фиксированный мазок, окрашивают суданом черным или суданом III в течение 5-15 минут (краситель при этом может высохнуть, но это не имеет значения). Затем краситель смывают, препарат подсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают ксилолом, несколько раз погружая в него препарат. Время просветления препарата в ксилоле не должно превышать 1 минуту. После этого клетки дополнительно окрашивают 0,5%-м раствором сафранина в течение 5-10 сек. Включения поли-бета-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие гранулы в розовой цитоплазме клеток.

Окраска полифосфатов (волютин, метахроматин). На тонкий, зафиксированный на горелке мазок, наносят метиленовую синь по Леффлеру и окрашивают в течение 10 минут. Краситель сливают, промывают, просушивают, микроскопируют с иммерсией. Клетки окрашиваются в голубой цвет, а зерна волютин - в фиолетово-красный.

Окраска волютина по Омелянскому. На фиксированный в пламени мазок наносят фуксин Циля и окрашивают клетки 0,5-1 минуту. Промывают препарат водой и обесцвечивают 1%-м раствором серной кислоты в течение 20-30 сек. Кислоту сливают, мазок промывают водой и дополнительно докрашивают метиленовым синим (в разведении 1:40) 20-30 сек. Препарат вновь промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.

Окраска волютина по Муромцеву. Тонкий фиксированный смазок культуры микроба окрашивают краской по Муромцеву 1 минуту. Мазок промывают водой, сушат и микроскопируют с иммерсией. Зёрна волютина окрашиваются в фиолетовый цвет, цитоплазма - в голубой.

Препараты для окрашивания включений.

1. Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы: йод кристаллический - 1 г, калий йодистый - 3 г, вода дистиллированная - 300 мл.

2. Судан III - 0,5 г, молочная кислота концентрированная - 100 мл.

2-а. 0,1 г судана III растворяют в 200 мл 96%-го спирта или концентрированной молочной кислоты.

3. Судан черный В - 0,3 г, 100 мл 70%-го горячего этилового спирта. Раствор выдерживают несколько часов в закупоренной склянке при 60°С, затем охлаждают и фильтруют.

4. Метиленовый синий 1:40. Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего - 1 мл, вода дистиллированная - 40 мл.

Е. Выявление нуклеоида и приготовление реактивов

а) Методы выявления

Метод Романовского-Гимза. Препарат фиксируют метиловым спиртом или фиксатором Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают этиловым спиртом и тщательно высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского-Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной водой (pH 7,2), высушивают и микроскопируют с иммерсией. Ядерные вещества окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма - в слабо-розовый.

Реакция Фельгена. Препарат обрабатывают фиксатором Карнуа в течение 5 мин., промывают абсолютным спиртом, гидролизуют 7 минут в растворе 1н. соляной кислоты, подогретой до 60°С, погружают на 1-2 минуты в холодную 1н. соляную кислоту и переносят в фуксинсернистую кислоту (реактив Шиффа) на 3-4 часа. Препараты последовательно промывают в трех кюветах с сернистой водой по 20 минут в каждой, затем споласкивают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Ядерное вещество окрашивается в фиолетовый цвет.

Модификация метода Фельгена. После гидролиза в соляной кислоте препарат немедленно промывают водой и помещают на 15 минут в 1%-й раствор формалина. Вновь промывают водой и окрашивают в течение 1-2 минут 0,1-1%-м водным раствором основного фуксина. Препарат промывают, высушивают, исследуют с иммерсией. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид - в ярко-малиновый.

б) Реактивы для выявления нуклеоида.

1. Фиксатор Карнуа: 96%-й этиловый спирт - 60 мл, хлороформ - 30 мл, ледяная уксусная кислота - 10 мл (время фиксации - 15 минут).

2. Краситель Романовского-Гимза: состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Перед употреблением к 10 мл красителя добавляют 10 мл дистиллированной воды (pH 7,2).

3. 1н. соляная кислота.

biofile.ru

5Окраска по Граму. Методика:

окрасить мазок генцианвиолетом (2 минуты,через фильтровальную бумагу);

бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

окрасить мазок раствором Люголя (1 минута);

раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло);

тщательно смыть спирт водой;

окрасить водным фуксином (2 минуты);

промыть водой и высушить.

Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – вкрасный Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это связано с наличием в клеточной стенке и мембране сравнительно большого количества липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными способами, поэтому используют концентрированные растворы с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой клетки, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена, который разработан с учетом все указанных особенностей Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:

нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);

бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);

тщательно промыть водой;

окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);

промыть водой и высушить.

Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску. Метод Ожешко.

нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);

слить кислоту, промыть водой, высушить;

зафиксировать в пламени;

окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.

Окраска включения волютина (по Нейссеру).

Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);

Окрасить раствором Люголя (30 секунд);
Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)
Промыть препарат и высушить

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные. Окраска по Бурри (обнаружение капсул).

Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с не окрашенными бактериями.

Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;

Высушить на воздухе и бактериоскопировать.

Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.

№6 Устройство светового микроскопа и техника иммерсионной микроскопии.

Предыдущая статья: Все течет все изменяется кто сказал Кому принадлежит высказывание все течет все изменяется Следующая статья: Все течет все изменяется кто сказал Все течет все изменяется автор данного высказывания